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膜再生液的配制方法以及注意事项

发布日期: 2017-02-07
浏览人气: 2283

膜再生液可在不影响抗原蛋白的情况下清除膜上结合的抗体。随后,可以使用不同的抗体进行下一轮Western Blot实验。一般stripping的原理都是利用蛋白变性以及利用beta-mercaptoethanol打开-s-s-,使一抗二抗解聚变性而被洗去,但洗脱的强度是一个关键,小了抗体洗不干净影响re-probe,大了又造成抗原的损失。

 

膜再生液的配制:

方法一:需要50℃温?。?/span>

Stripping Buffer:β-mercaptoethanol 342 μl;20% SDS 5 ml;1MTris-Cl pH 6.7 3.125 ml;加ddH2O50 ml。

方法:将用过的膜浸入stripping buffer中,置50℃水浴箱中30min,间断振摇。之后用TTBS洗5min/次洗到无beta-mercaptoethanol的味道就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。

 

方法二:(仅适用PVDF,但这种方法抗原损失少,抗体洗脱也比较干净,我们比较过后也一直在使用)

Stripping Buffer:50mM Glycine-NaOH(pH10.8), 7M Guanidine hydrochloride, 100mM KCl, 0.2mM EDTA, add 22.5uL beta-Mercaptoethanol/10mL stripping buffer just before use.

1) After ECL development, wash membrane once for 10min with TBST/PBST.

2) Incubate the membrane in stripping buffer in a shake for 6-8min at RT.

3) Washed stripped membrane at least 3x for 8min each with TBST/PBST, then re-block.

这种方法stripping buffer可以重复利用2次,用时也较快,当然基于盐酸胍的配方还有很多,附件中也附一篇使用盐酸胍的文章,文中也比较了几种stripping方法,希望对lz有帮助;

方法三:(实际上此法没有洗去一二抗,但此法是理论上抗原无损失的)

也在附件中附上原文,原理就和IHC中封闭内源过氧化物酶的道理是一样的。

 

膜再生液的注意事项:

1. 膜再生液实质是在不影响膜上结合的抗原的条件下将抗体洗脱下来, 实际操作中, 膜类型、 抗体类型、浓度及抗原特性都影响洗脱难易度。

2. 适用于 ECL 和类似的化学发光试剂进行的 Western 检测。不适用于非化学发光试剂进行的 Western检测,例如 DAB,NBT/BCIP。

3. 用 ECL 显色后,再生液洗脱几分钟后,可再次加入 ECL 显色液显影,如胶片上显示条带,表明抗体未除净,须进一步在再生液中浸泡,胶片上无显色。

4. 使用脱脂奶粉封闭的膜要比使用 BSA 封闭的膜更容易再生。

5. 尽量避免让膜干燥。

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